J Cell Biol. 2007 Sep 24;178(7):1207-21.
Actin-myosin network reorganization breaks symmetry at the cell rear to spontaneously initiate polarized cell motility.
Yam PT, Wilson CA, Ji L, Hebert B, Barnhart EL, Dye NA, Wiseman PW, Danuser G, Theriot JA.
Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA 94305, USA.
We have analyzed the spontaneous symmetry breaking and initiation of actin-based motility in keratocytes (fish epithelial cells). In stationary keratocytes, the actin network flow was inwards and radially symmetric. Immediately before motility initiation, the actin network flow increased at the prospective cell rear and reoriented in the perinuclear region, aligning with the prospective axis of movement. Changes in actin network flow at the cell front were detectable only after cell polarization. Inhibition of myosin II or Rho kinase disrupted actin network organization and flow in the perinuclear region and decreased the motility initiation frequency, whereas increasing myosin II activity with calyculin A increased the motility initiation frequency. Local stimulation of myosin activity in stationary cells by the local application of calyculin A induced directed motility initiation away from the site of stimulation. Together, these results indicate that large-scale actin-myosin network reorganization and contractility at the cell rear initiate spontaneous symmetry breaking and polarized motility of keratocytes.
PMID: 17893245 [PubMed - indexed for MEDLINE]
原文在，
http://www.jcb.org/cgi/content/abstract/178/7/1207
附件可以直接到JCB网站上看，
http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200706012/DC1
这篇文章，我想着重介绍他们使用的方法；其中涉及的Gaudenz Danuser组和
Paul W. Wiseman组是目前细胞生物学领域里面专注于分析光学显微镜的结果的杰
出代表。至于他们的研究结果，各人有各人的看法，我就不讨论了。
他们使用的细胞是金鱼的上皮细胞，叫keratocytes。这种细胞，十分规则，
在显微镜下很漂亮；而且细胞大而薄，极其适合光学显微镜分析：很多早期的细胞
生物学研究都是以其为模式细胞。唯一的缺点是不方便进行RNAi等遗传学操作。
第一个分析技术是，FSM，理论上就是分析众多的小的光学点的轨迹，研究它
们的速度，及产生和消失的动态变化。这篇文章，主要是用在对actin的动态分析
上。此项技术的要点在于只标记很小一部分的分子，从而产生speckle/散点的效
果。通常使用的方法有，一种是采用很弱的启动子，诱导小量表达；一种是显微注
射少量的荧光标记的蛋白；一种是采用TIRF只激发有限区域里的荧光分子。这里用
了另外的方法，使用了荧光标记的药物phalloidin，使用电击的方法导入细胞，从
而特异标记actin的多聚体。标记完后，就是采用高分辨率的物镜采集数据：这里
用的应该是60x物镜，加上2x的光学放大。一般采集活细胞数据的时候需要保持温
度和二氧化碳的浓度，对于keratocytes，只要合适的温度就够了！采集完后，就
要数据分析了。最早的FSM的文章里面有很详细的方法介绍，大概包括：鉴定荧光
散点，分析运动轨迹，作图。一般需要16小时完成一个数据的分析……
第二个分析技术是，STICS，这里仅仅使用来作为对第一个分析技术的补充。
本质上就是把数据中不动的荧光点先过滤掉，然后做图（velocity map）。相对第
一个技术，这里把16x16像素作为一个分析对象，相对精度低了点；但对于某些特
定的细胞结构还是很有效的。STICS的卓越之处在于可以对比两个不同荧光通道的
结果。
第三个分析技术是，自动标记细胞外周并分析其移动。这项技术很依赖于实际
的图像质量，并需要一定的手动参与。这里，作者改进了一个以前的算法：
gradient vector flow method，加以应用，构建了整篇文章的理论基础：“三步
走”的极化过程。操作大概是：非线性地调解像素，从而降低细胞内像素的差别；
通过一个bandpass过滤，放大细胞周边的细节（这两步是否需要人为参与不是很清
楚）；据此产生边界上的矢量（指向陡变的边界）；利用1998年的方法（由一名中
科大本科出来在jhu的工程学博士开发！），迭代产生扩散的矢量；再结合一开始
人为定义的边界，从而计算出各个时间点上的边界。细胞边界标记出来后使用一个
发表于2006年的力学模型（大概就是取前一时间点的曲线和当前时间点的曲线间的
最短距离）计算细胞边界各处的移动速度，作图，按照细胞圆周0-2pi，分别做出
各处的速度。
这些很大程度上依赖于高超的编程技术，主要是matlab。相对最原始的技术出
处，这里在应用上有不少细节的改动，有兴趣的可以讨论。
图一，分析actin的动态变化，说定向迁移前，actin是中心对称的；之后，就不是
了，两侧很快。
图二，分析了两个细胞，定向迁移前后的细胞各处的protrusion和retraction是不
同的，发现尾部先收缩，然后前部才突起。定义“三步走”的极化过程：尾部收缩，
尾部加速收缩，尾部收缩+前部突出。
图三，分析actin的动态变化，指出，在第二步的时候，两侧的actin速度剧增。
图四，指出“三步走”的极化过程中，细胞前沿的actin速度减慢了。
图五，各类药物处理，指出“三步走”的极化过程需要Rho Kinase和微管的活性。
图六，人为施加药物，可以促使细胞的极化过程。
图七，模型：很漂亮，也很清楚地阐明了作者的观点。
Leave a Reply