1 ES-cell200607024.pdf
2 ES-cellstemcell-1-55.pdf
3 ES-nature05934.pdf
4 ES-nature05944.pdf
大家好，今天我将尝试分析的是这个月初出现在干细胞研究领域的若干文章。这些
文章都是以e-pub的方式分别出现在nature和cell stem cell上，而同期正式出版
的nature居然还有另外一篇关于干细胞的文章（DOI: 10.1038/nature05879）：阐
述了不论何种状态的核都有reprogamming的能力，为制造病人特异性的干细胞提供
了更广泛的来源；文章使用了不少小技巧而实现这一目标；但是仍然没有摆脱对人
卵的依赖，影响远远没有我将要介绍的四篇来得大。因为我不是研究干细胞的，选
这个主题仅仅是因为兴趣；如果讲得不对，还请各位指正！
这四篇文章来自两个研究组，一个是日本的Shinya Yamanaka，他们组去年的
cell奠定了今天的另外三篇文章，所以我觉得是他们开创了干细胞研究的新领域。
虽然所有的研究都是以老鼠为对象，Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4这四个因子用在人
的细胞上面目前还没有任何作用；但是可以预见，类似的研究必定已经展开，乐观
估计使用reprogamming的方法培育产生的人干细胞不会存在相关伦理上的问题，具
有广泛的临床应用价值！另外一个研究小组是boston的Rudolf Jaenisch。此人参
与了whitehead研究所的建立，完成了不少早期的转基因小鼠工作；算起来还是本
人的scietific grand-grand-grand-father；目前在mitbbs上的biology版叱诧风
云的windysea正在他的实验室。他们的文章不仅体现了Rudolf在干细胞研究领域的
惊人影响力（跟随日本人的研究，一年以后便是nature）；更平息了各方对2006年
日本人工作的诸多看法，毋庸置疑地把今后干细胞研究的方向指向了reprogamming
上……
作为事件的起始，让我们翻开2006年八月的cell，看看Shinya究竟报导了什
么。一句话，他们说，使用特定的四个因子，能够把成纤维细胞（高度分化的）转
变为多能干细胞。图一，是他们的研究体系，在内源的Fbx15位点加上beta-geo；
如果细胞是多能的细胞，那么beta-geo就会表达，从而具有G418的抗性。通过对文
献的分析和良好的实验感觉，Shinya挑选了了24个因子，通过反转录病毒导入细
胞，然后进行药物筛选……16天后，他们拿到了抗药的克隆。这些“诱导生成的多能
干细胞”（iPS）具有和胚胎干细胞（ES）类似的外型：细胞小，核大，彼此间紧密
接触，能够呈现指数生长趋势。使用RT-PCR，他们证明三个iPS克隆或多或少表达
了ES的特征基因；而在启动子的甲基化程度上，也部分相似（虽然Oct3/4的启动子
部分还是类似于成纤维细胞）。这里使用的bisulfite genomic sequencing不知道
有没有同仁用过，效果如何？图二看起来很精练，实际上包括了很多的工作；他们
使用删减法，把24个因子缩小到了4个因子；然后使用图三图四各种分析手段，证
明在基因表达层面上，iPS很像ES细胞（当然，很明显，可以看到，iPS上的成纤维
细胞的甲基化印迹并没有被彻底清除）。他们使用teratomas生成实验来测试iPS的
多能性，如图五所示，iPS可以在很多组织诱导生成teratomas！随后，他们使用体
外分化实验，证明iPS可以在不同因子的诱导下分化产生三大胚层。日本的研究人
员不仅仅使用来自小鼠胚胎的成纤维细胞，在图六中，他们进一步利用从成年小鼠
（表达GFP）的尾巴得到的成纤维细胞，诱导产生iPS，并证明这些细胞同样具有和
ES类似的基因表达。进一步，通过blastocysts injection，证明利用iPS可以产生
小鼠嵌合体，而且iPS对小鼠的发育贡献很多！（只是在这里，他们没有能够实现
germline transmission，留出了进一步优化的空间。）图七，进一步从蛋白/RNA
水平上分析iPS，并指出iPS必须要有feeder cell才行（一般的ES细胞，可以不要
feeder cell，仅仅靠LIF而存活；实际上暗指iPS与ES还是不同的）。
去年的文章，石破惊天！但当时的学术界不是很确定，各种意见都有；仅仅四
个因子就能够reprogamming得到类似于ES的细胞？时钟指向了2007年的盛夏，两个
不同的研究小组报导了类似的结果：通过改变一开始的筛选方法，使用Nanog或者
Oct4作为选择标记，而不是Fbx15（Fbx15实际上并不是胚胎发育必须的，因为KO并
没有导致胚胎死亡），能够得到更加“强大”的iPS，具有和ES更加类似的基因组甲
基化模式，具有germline transmission的能力；这就是接下来的三篇文章。
我们还是先看日本组的工作。首先，他们在内源的Nanog位点上构建了一个
GFP-IRES-Puro；并证明由此产生的小鼠，体内的多能细胞是被绿色荧光标记的
（inner cell mass of blastocyst, primordial germ cells in 9.5dpc embryo,
genital ridges from 13.5dpc embryo）。由此，利用新的成纤维细胞（没有绿色
荧光），他们把四个因子放了进去（Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4）；使用适当的
puromycin选择时间与剂量，他们又一次拿到了iPS（具有绿色荧光），只不过这一
次这些细胞都是绿的！这些Nanog iPS同样可以指数生长，可以产生teratomas。相
比从Fbx15 iPS，Nanog iPS有更加类似于ES细胞的基因表达谱；更有意思的是，外
源用反转录病毒导入的那四个因子在iPS中并没有高表达，倒是相对应的内源基因
被诱导激活了！通过对iPS甲基化模式的分析，我们看到Nanog iPS更像ES了！当
然，使用Nanog iPS，他们拿到了germline transmission；因为在F2里面，他们拿
到了被修饰的Nanog的基因片断！到此，日本研究组用令人信服的证据指出，通过
使用四个因子，实现小鼠成纤维细胞reprogamming成ES like细胞，并实现
germline transmission！
回头，来看看在Boston的小组又找到了些什么。DOI: 10.1038/nature05944，
图一，他们利用Oct4-IRES-GFPneo和Nanog-IRES-GFPneo，拿到了iPS；他们报导了
拿到克隆的效率，很低（0.08%和0.05%；相对的，日本的工作指出，使用的
puromycin选择的时间和剂量会影响iPS的克隆效率）。分析甲基化水平，iPS和ES
类似。Rudolf的组更详细地分析了iPS对去甲基化/甲基化的耐受，实验方法是使用
Dnmt1 KD/Cre；我对此处图三的理解很表面化；如果有人清楚的话，不妨指点一
下？Boston的组也发现反转录病毒的表达在iPS里面被抑制了。为了证明iPS的发育
多能性，他们统计分析了2N/4N blastocyst注射的结果，分析了teratomas，也有
对iPS产生的小鼠的分析（他们发现不仅Oct4-IRES-GFPneo可以传到子代，甚至那
些viral表达的基因也传了下去）。这篇文章和日本组的文章同时发表，两个组都
是在二月份投的稿，估计在修改稿件的过程中，彼此有不少交流，因此不少结论都
是彼此支持的。
最后来看cell stem cell上的文章，这篇文章更加详细的分析了iPS对global
epigentic remodeling的作用。图一分析了Nanog-iPS的基因/蛋白表达特征，指出
利用Nanog来筛选得到的iPS可以在使用LIF的情况下摆脱对feeder cell的依赖（暗
指相对于Fbx15选择得到的iPS，他们的Nanog iPS 更加像ES细胞）；当然也使用
teratomas生成来证明iPS的多能性。图二，研究人员使用了细胞融合的方法来测试
iPS的多能性。具体说是把Nanog-GFP-Puro的iPS和含Hygo抗性的成纤维细胞电融
合，然后看生成细胞的特性：抗性以及荧光。使用电融合来证明细胞多能性的原理
我不是很清楚，有谁知道么？图三，作者进一步修改了原先的四因子反转录病毒导
入的方法；使用三因子病毒导入，而Oct4使用doxycycline进行诱导。他们的实验
证明由此产生iPS的具有多能性，可以诱导teratomas生成；而且产生的iPS中另外
一个Oct4位点是激活的！因此作者推测维持iPS需要Oct4的表达。图四是对甲基化
模式的分析，说明iPS和ES类似。图五图六是通过对X染色体失活状态的分析，证明
iPS的基因组是经历了reprogramming的；这方面的研究正是日本研究组欠缺的。具
体来说，图五中前面三个图是说在iPS中，两个X染色体上的Tist都是转录的，Xist
都是silence的；两个X染色体上都有基因表达，而且是整个X染色体都在转录中！
接着，通过使用失活的X染色体的分子标记来证明iPS两个染色体都没有失活。进一
步，作者又分析指出iPS能够分化，然后有正常的X染色体失活；这是一个很重要的
实验对照，证明iPS不是简简单单地失去了对X染色体的调控能力，而是整个X染色
体被reprogamming到了“原始”状态。图六实际上是进一步分析在诱导iPS体外分化
的过程中的X染色体失活情况；与图五不同的是，他们使用了从小鼠尾巴获取的成
纤维细胞诱导出来的iPS（文中名称TTF-driven iPS）。因为这个iPs拥有两条不太
一样的X染色体，可以很方便地利用GFP表达与否来计算X染色体的失活频率；结论
是iPS分化时的随机的X染色体失活与一般细胞相比是正常的。图七分析了全局的甲
基化；图八是使用小鼠实验证明iPS的多能性，当然展示了germline transmission
的证据（绿色的blastocyst）。
综上所述，在2006年研究的基础上，两个研究组各自独立地优化了iPS筛选方
案，从而得到了具有germline transmission能力的类似ES的多能干细胞！往前
看，希望能够出现比反转录病毒导入更安全的方法；因为目前的研究表明实际上外
源导入的四个基因在后来是不表达的，倒是内源的位点被激活了；暗示瞬时表达四
个因子可能就够了？当然我更期望看到相关的利用人的高度分化的细胞开展的研
究，如何找到需要的因子，如何设计合理的筛选方案，能否避免使用c-myc这种诱
癌因子……如果类似研究在人细胞上实现，那么我们将拥有无限的、病人特异的干细
胞来源，很多很多的疾病就会迎刃而解！一句话，只有想不到，没有做不到；让我
们等着看吧！
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