Nat Cell Biol. 2007 Aug;9(8):893-904. Epub 2007 Jul 8.
Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.
Wolf K, Wu YI, Liu Y, Geiger J, Tam E, Overall C, Stack MS, Friedl P.
Rudolf Virchow Center, DFG Research Center for Experimental Biomedicine and Department of Dermatology, University of Würzburg, Josef-Schneider-Strasse 2, 97080 Würzburg, Germany.
Invasive cell migration through tissue barriers requires pericellular remodelling of extracellular matrix (ECM) executed by cell-surface proteases, particularly membrane-type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP/MMP-14). Using time-resolved multimodal microscopy, we show how invasive HT-1080 fibrosarcoma and MDA-MB-231 breast cancer cells coordinate mechanotransduction and fibrillar collagen remodelling by segregating the anterior force-generating leading edge containing beta1 integrin, MT1-MMP and F-actin from a posterior proteolytic zone executing fibre breakdown. During forward movement, sterically impeding fibres are selectively realigned into microtracks of single-cell calibre. Microtracks become expanded by multiple following cells by means of the large-scale degradation of lateral ECM interfaces, ultimately prompting transition towards collective invasion similar to that in vivo. Both ECM track widening and transition to multicellular invasion are dependent on MT1-MMP-mediated collagenolysis, shown by broad-spectrum protease inhibition and RNA interference. Thus, invasive migration and proteolytic ECM remodelling are interdependent processes that control tissue micropatterning and macropatterning and, consequently, individual and collective cell migration.
PMID: 17618273 [PubMed - indexed for MEDLINE]
http://groups.google.com/group/99life/web/Wolf-et-al_07.pdf
本文研究的是癌症细胞在三维环境中入侵，结论是需要细胞表面的MT1-MMP蛋白酶对胶原进行水解从而实现多细胞的聚合入侵。
图一，MT1-MMP蛋白酶对癌症细胞三维环境中的迁移是必需的。a，实验体系，使用了非变性的胶原来制造体外的三维环境，这里证明普通的胰酶是无法降解这种三维材料的，需要MT1-MMP。b，使用FITC的释放来看酶解胶原的能力，证明细胞通过蛋白酶（可以被广谱蛋白酶抑制剂抑制）更进一步说是MT1 -MMP（被BB-2516 MT1-MMP特异性抑制剂抑制）实现胶原降解；而用抗体抑制integrin不会影响胶原降解，暗示两个不同通路。c，通过特性组织抑制剂TIMP-2 或者是siRNA来证明胶原降解是通过MT1-MMP的。d，通过分析三维环境中的迁移，发现抑制了MT1-MMP迁移变慢；抑制integrin迁移变慢；过表达MT1-MMP迁移变快；不仅说明MT1-MMP对癌症细胞迁移重要，而且也说明integrein对迁移的影响不同于MT1-MMP。
图二，癌症细胞在三维环境中迁移时是通过：前端integrin相关的粘附作用，中端MT1-MMP相关的胶原水解，来实现的。a，作者定义迁移细胞的三个区域。b，使用荧光标记的MT1-MMP，发现前端伪足虽然有MT1-MMP，但是没有胶原降解产物；暗示前端伪足区域没有胶原水解。c，对b图的荧光分布进行了一下分析，证明他们的观点，仅仅在区域二有胶原的水解。d，在胶原水解产物分析的基础上，分析integrin的分布。e，对d荧光分布的分析，区域一有很高的integrin信号，没有胶原水解产物；据此，作者有了一个模型，在三维环境中的迁移，前端伪足属于区域一，有integrin相关的粘附作用；其后是区域二，有大量的MT1-MMP涉及的胶原降解。g，区域一没有胶原水解产物。h，胶原水解区域离integrin富集的区域有大概 10微米的距离。i，在使用抗体来抑制integrin活性后，癌症细胞没有拉长的形态，从而导致胶原产物被动的富集在integrin周围了；暗示 integrin的粘附及后续的细胞骨架的机械力导致了区域一与区域二的分离。
图三，使用了DQ-FITC来进一步证明作者的观点。a，DQ-FITC胶原的工作原理是因为多聚化状态的胶原的荧光彼此促灭，仅当水解成单体后荧光才会显示出来。b，使用整体都荧光标记的细胞，结合使用DQ-FITC胶原，证明在区域二，差不多就是伪足分叉的部分有大量的胶原水解。c，对b的荧光分布进行细致分析，证明在区域二，紧靠着细胞周围大量的胶原水解了，呈现带状/环状。def，在细胞迁移过程中的胶原纤维的重新分布。这里的分析手段比较不错，不同的时刻采用不同的颜色，从而在f中放在一起表示出来；很明显的两个胶原纤维彼此靠近了。
图四，抑制了蛋白酶后，细胞还是可以动的，但是因为要钻过胶原纤维结构，导致了细胞核结构变化了。a，细胞核被卡着而拉长。b，比较有没有抑制剂的情况下细胞核的状态。c，b的定量分析。
图五，高的胶原浓度下，细胞迁移很依赖于MT1-MMP。a，抑制了蛋白酶后，没有胶原降解了。b，不同胶原浓度下的不同的癌症细胞扩散迁移的轨迹。c，定量。结论是，随着胶原浓度增加，细胞迁移变慢；高浓度的胶原，如果没有蛋白酶，癌症细胞扩散速度减慢50%。其实这里的东西很容易理解：孔道复杂之后不管有没有水解，细胞要通过的障碍物变多，速度减慢；如果有胶原水解作用的帮助，癌症细胞能够相对容易的实现“钻孔”。
图六，多细胞聚合侵入的视觉化。a，电镜重构照片，看到癌症细胞移动之后留下了空的胶原“轨道”。b，荧光共聚焦的照片，与a类似的结论。cd，癌症细胞扩散的时候，一部分的通道里挤了很多细胞，或者说当一个胶原通道形成后，后续的细胞就“狠命”地挤着跟上去。efgh，使用了不同的胶原浓度来构建三维环境，得到类似结论；这里使用了荧光信号的三维重建，展示了不同的切面。用各种浓度可能是为了说明在各种不同环境下，这种多聚入侵的状态都是存在的。
图七，使用乳腺癌细胞，抑制蛋白酶后，细胞只能排队一串串的往前入侵，不能聚合入侵了。分析的方法是对降解产生的胶原通道进行定量分析，同时结合相对位置的细胞数；明显的，加了蛋白酶抑制剂后，只有“单串入侵”了。比较可惜的是，这里没有用MT1-MMP特异性的抑制剂；虽然后面一张图和附件里面用了 siRNA的手段，我还是比较期待看到使用BB-2561或者GM6001的结果的。
图八，用siRNA的方法说明MT1-MMP对于癌症细胞的聚合是必须的。a，用RNAi耗尽MT1-MMP，没有胶原降解。bcd，RNAi MT1-MMP之后，都是单串的细胞入侵模式了。e，RNAi MT1-MMP之后，细胞核拉长；暗示那是因为没有胶原降解，细胞核被“卡”住了。f，通过分析胶原通道的宽度与荧光强度（胶原降解产物），说明过表达 MT1-MMP有最宽的迁移通道，使用蛋白酶抑制剂或者RNAi MT1-MMP之后，迁移通道宽度骤然变小。
文章使用了多种显微镜技术以及图像分析手段，我觉得做得不错；字里行间含有很多信息。这个研究的一大缺陷是分析的样品量略少；而且BB-2516或者 GM6001的使用少了一点，我觉得，如果作者能够大量使用特异性的抑制剂而不是广谱的蛋白酶抑制剂来做试验的话，结果会更加令人信服。各位如何看？
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